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中山市飛步腳輪有限公司
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金鉆腳輪電泳技術-中山市飛步腳輪有限公司

金鉆腳輪電泳技術


發表時間:8:13:41

 

 

五種金鉆腳輪電泳技術的比較
SDSPAGE
  名詞解釋:
  相對遷移率(Rf)
  問答題:
  1.簡述SDS-PAGE的基本原理。
  2.影響SDS金鉆腳輪電泳的關鍵因素有哪些?  AGE
 名詞解釋
1.遷移率
2.電滲
3.金鉆腳輪電泳
 問答題
1.影響金鉆腳輪電泳遷移率的因素有哪些?
2.試述瓊脂糖凝膠金鉆腳輪電泳分離脂蛋白的原理。 CAME
1.CAME的基本原理是什么?
2.CAME分離血清蛋白金鉆腳輪電泳時應注意哪些問題? PAGE
名詞解釋
1.凝膠總濃度
2.交聯度
問答題
1.與CAME相比,PAGE有哪些特點。
2.試比較CAME與PAGE操作的區別。
3.簡述不連續PAGE的原理。 
1.瓊脂糖凝膠金鉆腳輪電泳Agarose Gel Electrophoresis
 Gel Electrophoresis :由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質作支持體的金鉆腳輪電泳。
 特點(characteristic):
1.可以制成非常均勻的凝膠,帶電質點在凝膠的孔中泳動。 
2. 金鉆腳輪電泳操作方法簡便,金鉆腳輪電泳速度快。
3. 分辨率高,重復性好,金鉆腳輪電泳圖譜清晰。
4. 適用于生化,免疫等定性定量測定。
(一)優點(advantage)
1.因不含硫酸根和羧基,幾乎消除了瓊脂的電滲。
2.對蛋白質吸附極微,故無拖尾現象。
3.凝膠結構均勻,孔徑較大,可用來分離酶的復合物、核酸、病毒 等大分子物質。
4.透明度較好,可直接或干燥成薄膜后進行染色。
5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量測定。
6.有熱可逆性。
(二)缺點(disadvantage)
1.機械強度差,易破碎,濃度不能太低。
2.易被細菌污染,不易保存,臨用前配制。
3.瓊脂糖支持層上的區帶易于擴散,金鉆腳輪電泳后必須立即固定染色。
4.與PAGE相比,分子篩(molecular sieve)作用小,區帶少。 
應用
1. 適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化
2. 臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測
3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標
  影響遷移的因素
 
瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白
原理:      血清脂蛋白經飽和蘇丹黑B預染后,以瓊脂糖凝膠為支持介質,在pH8.6巴比妥緩沖液中金鉆腳輪電泳,根據各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區帶。
 pH 8.6 > pI ,各種脂蛋白均帶負電,金鉆腳輪電泳時由負極到正極;VLDL為圓形,受阻力小,LDL形態不規則,受阻力大,所以VLDL跑在前。
加樣槽在負極,由負極到正極分別是CM\LDL\VLDL\HDL
2.醋酸纖維薄膜金鉆腳輪電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis,CAME
特點:低吸附作用,低電滲作用,樣本用量少,親水性
1.Low sorption
2.Low electroosmosis 
3.Small sample
4.Hydrophilic 
金鉆腳輪電泳圖譜不齊
①點樣時血清點加不均勻
②薄膜局部干燥
③金鉆腳輪電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少
④緩沖液變質
⑤金鉆腳輪電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行 
金鉆腳輪電泳圖譜分理不清
①點樣時血清點加不均勻
②薄膜局部干燥
③金鉆腳輪電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少
④緩沖液變質
⑤金鉆腳輪電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行 
金鉆腳輪電泳速度慢
1. 濃縮效應
1)凝膠層的不連續性
  兩層凝膠T與C不同孔徑不同
  濃縮膠孔徑大,分離膠孔徑小,蛋白質在大孔徑濃縮膠中移動,受阻力小,移動速度快。
 2)緩沖液離子成分的不連續性
甘氨酸(pI=6.0)在pH8.3帶負電,朝正極移動,進入濃縮膠(pH6.7),甘氨酸解離度()很小,有效遷移率(M )很低,移動速度較慢,稱為慢離子。
HCl 是強電解質,=1,Cl-有效遷移率大,移動速度快,稱快離子。
蛋白質(pI<6.0)帶負電荷,有效遷移率介于兩者之間。 
3)pH值的不連續性
     為了控制慢離子的解離度,從而控制其有效遷移率,必須使濃縮膠與分離膠之間pH值有所區別。
3.分子篩效應與電荷效應
    進入分離膠后,Gly-成為快離子
    分離膠只有電荷效應和分子篩效應,根據各蛋白質所帶電荷不同、分子大小不同而分離
PAGE特點
1.具有分子篩效應,分辨率高
2.樣品不易擴散,用量少,靈敏度可達10-6g
3.化學性質穩定,分子結構中富含酰胺基具有穩定的親水基團
4.凝膠不帶電荷,消除了電滲現象
5.機械強度好,有彈性,在一定濃度范圍內無色透明
6.網孔可調節  4.SDSPAGE
十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate)
是一種陰離子去污劑(anionic detergent )。
? 作用:破壞蛋白質分子之間以及其他物質分子之間的非共價鍵,使蛋白質變性
(denature)而改變原有的構象;
? 保證蛋白質分子與SDS充分結合而形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。
原理

 
 電流過低
 供給薄膜的液量不足
 緩沖液離子強度過高
 薄膜中雜質 
白蛋白區帶中間部分不著色,染色不足
染色時間不夠、點樣過多
γ球蛋白向反方向移動
電滲現象,可提高緩沖液液面或加大電流量以改進
區帶一邊長一邊短呈扭曲現象
薄膜未緊壓在金鉆腳輪電泳槽的濾紙橋上,使薄膜接觸不良而增大了電阻。 
區帶拖尾或區帶過于緊密
緩沖液離子強度<0.05可出現區帶拖尾;離子強度>0.075可出現區帶過于緊密。
血清蛋白質醋酸纖維薄膜金鉆腳輪電泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis
[原理] CAME是以醋纖膜(CAM)作支持物的一種區帶金鉆腳輪電泳技術。
      將血清樣品點樣于醋纖膜上,在pH8.6的緩沖液中金鉆腳輪電泳時,血清蛋白質均帶負電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點不同而致表面凈電荷量不等,加之分子大小和形狀各異,因而金鉆腳輪電泳遷移率不同,彼此得以分離。加樣:用加樣器蘸取血清約5ul,垂直印在CAM粗糙面,點樣區距離邊緣約1.5cm,金鉆腳輪電泳時點樣面朝下。加上槽蓋平衡5分鐘后再通電。電壓10~15V/cm膜總寬。金鉆腳輪電泳40~60分鐘,泳動距離約達3.5~4cm時即可斷電。
由負極到正極可分為五條條帶
γ β α2 α1 白蛋白
3.聚丙烯酰胺凝膠金鉆腳輪電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE
        PAG是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)單體和N,N'-亞甲雙丙烯酰胺(N,N,N',N'-methylene bisacrylamide,Bis)交聯劑通過自由基( free radicals)聚合而成的一種多孔三維網狀結構。
    過硫酸胺[(NH4)2S2O8](Ammonium persulfate,AP)作為催化劑,四甲基乙二胺(-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine , TEMED)為加速劑。 
?TEMED量多少都會影響催化作用,須在堿性條件下聚合
  -分子氧存在,聚合不完全,須去除分子氧,隔絕氧
  ?升高溫度能提高聚合,降低溫度能延遲聚合
PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?梢愿鶕蛛x物質分子的大小,選擇合適的單體濃度。
Acr/Bis:20~40   完全透明且有彈性;
         <10    很脆,易碎,不透明;
         >100   糊狀不成形,易破碎
常用的標準凝膠是指濃度為7.5%的凝膠
交聯度C——Bis占單體與交聯劑總量的百分比。
C=b/(a+b)×100%
電極槽緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液 
分離原理
(一)蛋白質分子的解聚
    樣品介質和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后,蛋白質亞基的金鉆腳輪電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小(molecular mass of polypeptides ),而電荷因素可以被忽略。
1、SDS
   陰離子去污劑(anionic detergent )
   變性劑(denaturant)
   助溶性試劑 
    斷裂分子內和分子間的氫鍵(hydrogen bond)
    分子去折疊
    破壞蛋白質分子的二級和三級結構
2、強還原劑
   巰基乙醇(β-mercaptoethanal)
   
   二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT) 
   使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(disulfide bond)斷裂。
 SDS和還原劑的作用:
(1)分子被解聚
(2)氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負  
     電荷的蛋白質-SDS膠束。
(3)蛋白質-SDS膠束所帶的負電荷大大超   
     過了蛋白質分子原有的電荷量,消除
     了不同分子之間原有的電荷差異。
去污劑的選擇
無離子去污劑:Lubro W;Brij35, Tween    
              Triton
陽離子去污劑:cetyltrimethyl ammonium 
              bromide (CTAB)
              cetylpyyridinium (CPC)
陰離子去污劑:SDS   deoxycholate
金鉆腳輪電泳過程中的不正,F象
(1)“微笑”現象
    指示劑前沿呈現兩邊向上的曲線形,說明凝膠的不均勻冷卻,中間部分冷卻不好。
2)“皺眉”現象
    由于垂直金鉆腳輪電泳槽的裝置不合適引起的,特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。
(3)“拖尾”現象
     樣品溶解不佳引起。
(4)“紋理”現象
由于樣品中的不溶顆粒引起的。
(5)偏斜現象
    電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起
(6)帶太寬
     加樣量太多或加樣孔泄漏引起
分子量測定
1、相對遷移率(relative mobility ,Rf)
  Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。
  測量位置應在蛋白帶的中央。 
      蛋白帶遷移距離
Rf=  ————————
      溴酚藍遷移距離
蛋白帶遷移距離      固定前的凝膠長度
   Rf= ————————— X  —————————    
     干燥后的凝膠長度      溴酚藍遷移距離
2、作圖
   以已知蛋白質分子量的常用對數值為縱坐標,Rf為橫坐標繪圖
3、通過測定未知蛋白質的Rf值,便可在標   
   準曲線上讀出他的分子量
5.等電聚焦金鉆腳輪電泳Isoelectric Focusing Electrophoresis, IEFE 
等電聚焦金鉆腳輪電泳(IEFE)是一種利用具有pH梯度的支持介質分離等點電(PI)不同的蛋白質的金鉆腳輪電泳技術。
原理:    在金鉆腳輪電泳介質中加入載體兩性電解質,通電后,兩性電解質會逐漸形成一個由正極到負極遞增的pH梯度,在此體系中,不同的蛋白質移動并聚焦于與其等電點相當的pH位置。
理想的載體兩性電解質應具備的特征
①化學性質穩定;
②分子量要小
→以便與被分離大分子物質分離;
③各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的緩沖能力
→梯度穩定;
④兩性電解質載體的數目要足夠多
→梯度平滑 ;
⑤對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度
→不影響測定。
優點: 
 分辨率高(可達0.01pH單位);
 靈敏度高(最低檢出量達0.1ng);
 金鉆腳輪電泳區帶狹窄;
 重復性好。
缺點: 
 要求用無鹽溶液,而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀; 
 由于樣品中的成分會停留在其pI,不適用在pI不溶的蛋白質。
IEFE應用 
 1.分析分離制備蛋白質、多肽 
 ①區分人血清蛋白 
 ②測出異常免疫球蛋白 
 ③基因分型 
 ④csf中寡克隆區帶的檢測 
 2.測定pI可鑒定蛋白質、多肽 
 3.雙相金鉆腳輪電泳中,IEFE作為第一相
 



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